La citometria a flusso (FCM) è un analizzatore cellulare che misura l'intensità di fluorescenza dei marcatori cellulari colorati. Si tratta di una tecnologia ad alta tecnologia sviluppata sulla base dell'analisi e della classificazione di singole cellule. Può misurare e classificare rapidamente le dimensioni, la struttura interna, il DNA, l'RNA, le proteine, gli antigeni e altre proprietà fisiche o chimiche delle cellule, basandosi sulla raccolta di queste classificazioni.
Il citometro a flusso è costituito principalmente dalle seguenti cinque parti:
1 Camera di flusso e sistema fluidico
2 Sorgente luminosa laser e sistema di modellazione del raggio
3 Sistema ottico
4 Elettronica, sistema di archiviazione, visualizzazione e analisi
5 Sistema di smistamento cellulare
Tra queste, l'eccitazione laser nella sorgente di luce laser e nel sistema di formazione del fascio è la principale misura dei segnali di fluorescenza nella citometria a flusso. L'intensità della luce di eccitazione e il tempo di esposizione sono correlati all'intensità del segnale di fluorescenza. Il laser è una sorgente di luce coerente in grado di fornire un'illuminazione a lunghezza d'onda singola, ad alta intensità e ad alta stabilità. È la sorgente di luce di eccitazione ideale per soddisfare questi requisiti.
Tra la sorgente laser e la camera di flusso sono presenti due lenti cilindriche. Queste lenti focalizzano un raggio laser a sezione circolare emesso dalla sorgente laser in un raggio ellittico con sezione trasversale più piccola (22 μm × 66 μm). L'energia laser all'interno di questo raggio ellittico è distribuita secondo una distribuzione normale, garantendo un'intensità di illuminazione costante per le cellule che attraversano l'area di rilevamento laser. Il sistema ottico, invece, è costituito da più set di lenti, fori e filtri, che possono essere suddivisi approssimativamente in due gruppi: a monte e a valle della camera di flusso.
Il sistema ottico davanti alla camera di flusso è costituito da una lente e da un foro stenopeico. La funzione principale della lente e del foro stenopeico (solitamente due lenti e un foro stenopeico) è quella di focalizzare il raggio laser con sezione circolare emesso dalla sorgente laser in un raggio ellittico con sezione più piccola. Questo distribuisce l'energia laser secondo una distribuzione normale, garantendo un'intensità di illuminazione costante per le cellule in tutta l'area di rilevamento laser e riducendo al minimo l'interferenza della luce diffusa.
Esistono tre tipi principali di filtri:
1: Filtro passa-lungo (LPF): lascia passare solo la luce con lunghezze d'onda superiori a un valore specifico.
2: Filtro passa-corto (SPF): lascia passare solo la luce con lunghezze d'onda inferiori a un valore specifico.
3: Filtro passa-banda (BPF): lascia passare solo la luce in un intervallo di lunghezze d'onda specifico.
Diverse combinazioni di filtri possono indirizzare segnali di fluorescenza a diverse lunghezze d'onda verso singoli tubi fotomoltiplicatori (PMT). Ad esempio, i filtri per la rilevazione della fluorescenza verde (FITC) davanti al PMT sono LPF550 e BPF525. I filtri utilizzati per la rilevazione della fluorescenza rosso-arancio (PE) davanti al PMT sono LPF600 e BPF575. I filtri per la rilevazione della fluorescenza rossa (CY5) davanti al PMT sono LPF650 e BPF675.
La citometria a flusso viene utilizzata principalmente per la separazione cellulare. Con il progresso della tecnologia informatica, lo sviluppo dell'immunologia e l'invenzione della tecnologia degli anticorpi monoclonali, le sue applicazioni in biologia, medicina, farmacia e altri campi stanno diventando sempre più diffuse. Queste applicazioni includono l'analisi della dinamica cellulare, l'apoptosi cellulare, la tipizzazione cellulare, la diagnosi tumorale, l'analisi dell'efficacia dei farmaci, ecc.
Data di pubblicazione: 21 settembre 2023
